图1

随着样品量继续增加，进到色谱柱中的样品达到饱和，谱峰就变形了。

        图2

从图2可以看出，随着进样质量不断增加，谱峰峰宽不断增加，最终变成了直角三角形的形状，同时谱峰的理论塔板数也不断降低。通常，对于内径为4.6mm的色谱柱，其载样量<50μg。如果是做方法转移到其他色谱柱上，则需要调整进样量，防止出现过载。

载样量主要与色谱柱固定相和待分析物的性质有关。首先固定相类型不一样，品牌不一样会造成载样量较大的差异。其次待分析物质性质也会直接影响到色谱柱载样量。例如离子态的碱性化合物就很容易过载，不仅无法达到<50μg的量级，有时候甚至1μg的量就能造成过载的现象。因此在常规疏水反相中，分子态的碱性化合物比离子态的碱性化合物有着更高的载样量。目前的推测原因是，离子态间互相排斥作用使得待分析组分在固定相表面更易达到饱和而造成过载。同时离子态的带正电的碱性化合物也更容易和固定相中未键合的活性硅羟基发生次级相互作用。针对质量超载的问题，最简单的方法则是减少进样量。

另外，混合样品进样中过载还会导致峰保留时间的变化。

        图3

例如图3中，A’，B’为AB组分单独进样时的保留分离情况。A，B为混合进样时的保留分离情况。过载的B不管是单独进样还是混合进样，均保持稳定，而A由于过量B的存在，在混合进样时，保留时间提前。

虽然每个成分的过载是相对独立的，但是在混合样品进样过程中会引起的分离度问题。这是由于环境对组分的影响。其中某一组分过载很可能造成混合进样时保留时间相对于单独进样时有所改变。

体积过载

进样体积太大通常会导致较宽的平头峰。

          图4

从图4可以看出，随着进样体积的增大，峰宽逐渐变宽，峰分离度降低。

另外体积过载还会影响峰保留时间，体积过载对保留时间短的组分影响更大，而对于较后面流出的峰影响较小。

         图5

图5中虚线为正常体积进样，实线色谱图为体积过载后的色谱图。

那么，如何选择合适的进样体积呢？

对于在最佳流速下 ，允许样品进样的最大体积为：

其中：L为柱长（mm），dc为内径（mm），dp为粒径（μm）

实验室常用的各规格色谱柱：

尽管上表中各个数据是严格按照公式计算出来的，但是这个数据并不绝对。色谱是经验科学，较之其他学科需要更多的实践。当然，理论也为我们指引了方向，让我们能少走弯路。